La histidina proporciona larga

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 15356 (2015) Citar este artículo

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La formación de cicatriz glial impide la neurogénesis y la recuperación funcional neural después de la isquemia cerebral. La histamina mostró neuroprotección en etapas tempranas después de la isquemia cerebral, sin embargo, su efecto a largo plazo, especialmente en la formación de cicatrices gliales, no ha sido caracterizado. Con varios regímenes de administración elaborados para la histidina, un precursor de la histamina, descubrimos que el tratamiento con histidina en una dosis alta en la etapa temprana y una dosis baja en la etapa tardía demostró la neuroprotección a largo plazo más notable con una disminución del volumen del infarto y una función neurológica mejorada. En particular, este régimen de tratamiento también redujo considerablemente el área de la cicatriz glial y facilitó la migración de astrocitos hacia el núcleo del infarto. En el ensayo de curación de heridas y la prueba Transwell, la histamina promovió significativamente la migración de astrocitos. Los antagonistas de los receptores H2 revirtieron la promoción de la migración de astrocitos y la neuroprotección proporcionada por la histidina. Además, la histamina regulaba al alza la pequeña GTPasa Rac1 unida a GTP, mientras que un inhibidor de Rac1, NSC23766, anulaba la neuroprotección de la histidina y su promoción de la migración de astrocitos. Nuestros datos indicaron que un tratamiento con histidina dependiente de la dosis/etapa, mediado por el receptor H2, promovió la migración de astrocitos hacia el núcleo del infarto, lo que benefició la recuperación neurológica a largo plazo posterior a la isquemia cerebral. Por lo tanto, dirigirse al sistema histaminérgico puede ser una estrategia terapéutica eficaz para la lesión por isquemia cerebral a largo plazo a través de sus acciones sobre los astrocitos.

La isquemia cerebral es la principal causa de muerte y discapacidad en adultos. Actualmente, el único tratamiento aprobado para la isquemia cerebral es el activador tisular del plasminógeno recombinante, que confiere reperfusión al área isquémica cuando se administra dentro de las 4,5 h posteriores a la isquemia. Todavía no se dispone de ningún agente neuroprotector terapéutico eficaz para las lesiones cerebrales a largo plazo después de la isquemia. Los complejos eventos fisiopatológicos posteriores a la isquemia cerebral evolucionan tanto temporal como espacialmente1, lo que dificulta el desarrollo de un agente neuroprotector viable2. Por ejemplo, los antagonistas de NMDA son efectivos para aliviar la excitotoxicidad neuronal en la etapa temprana después de la isquemia, mientras que pueden no favorecer la recuperación neurológica a largo plazo, ya que los receptores de NMDA son cruciales en la neuroplasticidad3,4.

Los astrocitos tienen una participación crítica en los progresos fisiopatológicos neuronales que siguen a la isquemia cerebral: tan pronto como 6 h después del inicio de la isquemia cerebral, los astrocitos se activan para facilitar la supervivencia de las neuronas, posiblemente a través de la defensa antioxidante, el apoyo metabólico y la secreción de sustancias neuroprotectoras; esos astrocitos reactivos también forman una barrera para confinar la extensión de la lesión y la respuesta inmune local5,6. Por lo tanto, una mejora en la supervivencia de los astrocitos es un medio crucial para proteger el cerebro contra la isquemia cerebral7. Sin embargo, la cicatriz glial, una barrera compuesta en gran parte por astrocitos, puede impedir la neurogénesis en la última etapa de las lesiones neuronales isquémicas. De hecho, la supresión de la cicatriz glial puede beneficiar la neurogénesis y la recuperación neurológica8. Plantea la posibilidad de que la estrategia de tratamiento dependiente de la dosis y la etapa pueda ser una forma razonable de terapia para las lesiones cerebrales isquémicas mediante la coordinación de los efectos dependientes del tiempo de los astrocitos.

En nuestro estudio anterior, se encontró que la histamina protege significativamente a los astrocitos de las lesiones inducidas por la privación de oxígeno y glucosa9. La regulación al alza mediada por el receptor H1 astrocítico de las expresiones de glutamina sintetasa y transportador de glutamato 1 contribuye al efecto protector de la histamina a través de la eliminación del glutamato extracelular redundante, lo que ayuda a aliviar la excitotoxicidad en la etapa temprana de la isquemia cerebral9,10. Además, considerable evidencia muestra que la histamina brinda neuroprotección en etapas tempranas después de la isquemia cerebral11,12. La administración intraperitoneal de histidina, un precursor de la histamina, inmediatamente y 6 h después de la reperfusión, alivia notablemente el infarto inducido por la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO)11. Se considera que la histamina tiene un efecto neuroprotector directo al aliviar la excitotoxicidad inducida por NMDA a través de los receptores H2 y la vía cAMP/PKA13. Además, el aumento de la actividad histaminérgica central suprime el reclutamiento de células inflamatorias después de la isquemia cerebral14. En conjunto, el sistema histaminérgico parece ser un objetivo terapéutico potencial para las lesiones cerebrales inducidas por isquemia cerebral.

Sin embargo, no se ha investigado el efecto a largo plazo de la histamina después de la isquemia cerebral, especialmente su efecto sobre los astrocitos en la última etapa de la formación de la cicatriz glial. Dado que la histamina no puede penetrar la barrera hematoencefálica directamente, se usó histidina para probar los efectos a largo plazo de la histamina en las respuestas conductuales e histológicas a la isquemia cerebral y los posibles mecanismos bajo diferentes regímenes de administración relacionados con la etapa.

Los eventos fisiopatológicos posteriores a la isquemia cerebral son complicados, es decir, la excitotoxicidad aguda y la infiltración inflamatoria suelen ocurrir dentro de la semana posterior al inicio de la isquemia, mientras que la formación de cicatriz glial y la neurogénesis suelen aparecer después de eso1. Así, en un principio experimentamos las dosis de histidina (200, 500 o 1000 mg/kg) durante la primera semana, que suelen ser dosis seleccionadas en el estudio de la isquemia cerebral11,15,16. Descubrimos que la dosis más alta proporcionó la protección más destacada, como lo demuestra la puntuación del déficit neurológico (Fig. 1A; n = 13-15) y la medición del área del infarto por resonancia magnética (Suplemento Fig. 1; n = 5-6). Así, se eligió 1000 mg/kg como dosis para la primera semana y se administraron otras dosis diferentes para las semanas posteriores. Bajo diferentes regímenes de tratamiento (como se indica como combinación de dosis temprana y dosis tardía), evaluamos los efectos a largo plazo de la histidina en el rendimiento neurológico y las capacidades cognitivas mediante el uso del laberinto acuático de Morris y la prueba de condicionamiento del miedo, para las regiones cerebrales relacionadas con la memoria, como el cuerpo estriado, el neocórtex y la amígdala a menudo se ven comprometidos después de tMCAO17,18,19,20. Encontramos que el tratamiento con histidina (1000–500 mg/kg) mostró el efecto protector más notable sobre el rendimiento neurológico (Fig. 1B; n = 13–15 para el día 14 y el día 28; n = 7–9 para el día 42 y el día 28). día 56). En la prueba del laberinto de agua de Morris realizada entre 22 o 50 días después de la isquemia, todos los tratamientos con histidina redujeron significativamente la latencia de escape en el proceso de aprendizaje espacial (analizado mediante un modelo lineal general, P < 0,05; Fig. 1D: n = 13–15; Fig. 1F: n = 7-9). Sin embargo, no hay diferencia entre ellos en la prueba de prueba, que se refiere a la retención de memoria. En la prueba de condicionamiento del miedo, el grupo Histidine (His) 1000–500 mostró la mejor memoria contextual y memoria con claves en 27 d y 55 d, en comparación con otras combinaciones de tratamiento (Fig. 1E: n = 13–15; Fig. 1G: n = 7–9).

La histidina proporciona neuroprotección sobre la función neurológica y las capacidades cognitivas después de una isquemia cerebral focal.

Las puntuaciones neurológicas se evaluaron en 1 día, 3 días, 7 días después de la isquemia bajo el tratamiento de histamina (A, 200, 500 o 1000 mg/kg) y se evaluaron en 14 días, 28 días, 42 días, 56 días después de la isquemia bajo el tratamiento de histamina. tratamiento del tratamiento con histidina (B, 1000 mg/kg durante la primera semana pero 0, 200, 500 o 1000 mg/kg para las semanas posteriores, denominadas His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 o His 1000 –1000). Las habilidades cognitivas se examinaron mediante el laberinto acuático de Morris (D: Día 22-24; F: Día 50-52) y la prueba de condicionamiento del miedo contextual y con claves (E: Día 27, G: Día 55) después de la isquemia. Las trayectorias de nado representativas del día 24 en (D) se muestran en (C) y el círculo gris indica la ubicación de la plataforma. n = 13–15 para A,B (Día 14 y Día 28), D y E; n = 7–9 para B (Día 42 y Día 56), F y G. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, en comparación con el grupo simulado dentro de cada día de prueba o cada prueba, # P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, en comparación con el grupo tMCAO dentro de cada día de prueba o cada prueba.

Luego realizamos la evaluación histológica siguiendo diferentes regímenes de tratamiento con histidina. Al usar la tinción con azul de toluidina (TB) en 28 d y 56 d después de tMCAO, encontramos que solo las combinaciones His 1000–200 y 1000–500 redujeron notablemente el área del infarto (Fig. 2A, C: n = 10–12; Fig. 2E: n = 6–7). El área de la cicatriz glial alrededor del núcleo del infarto se cuantificó a partir de la tinción histoquímica con diaminobencidina GFAP. Solo el tratamiento con His 1000-500 redujo considerablemente el área de la cicatriz glial en 28 d y 56 d después de la isquemia (Fig. 2B, D: n = 10-12; Fig. 2F: n = 6-7). No se detectó ningún cambio estadísticamente significativo en el área de la cicatriz glial entre el tMCAO y otros grupos de tratamiento con histidina. En conjunto, estos datos demuestran que la histidina proporciona neuroprotección a largo plazo después de la isquemia cerebral y el tratamiento con His 1000–500 mostró la protección más sólida sobre la función neurológica y la reducción de la formación de cicatrices gliales.

La histidina reduce el área del infarto y el área de la cicatriz glial después de la isquemia cerebral focal.

Bajo los diferentes regímenes de tratamiento con histidina, el área de infarto se estimó con tinción de TB en 28 d (C) y 56 d (E) después de tMCAO, con la capa representativa que se muestra en (A). El área de la cicatriz glial también se estimó con tinción GFAP en 28 d (D) y 56 d (F) después de tMCAO, con la foto representativa que se muestra en (B) (B1 muestra el área cuantificada; B2-B5 muestra el borde de la cicatriz glial ampliada ). n = 10–12 para C y D; n = 6–7 para E y F. B1: barra = 500 μm; B2–5: barra = 100 μm. *P < 0,05, ***P < 0,001, en comparación con el grupo tMCAO.

La formación de la cicatriz glial generalmente es el resultado de cambios morfológicos y funcionales de los astrocitos que incluyen la activación con regulación positiva de GFAP, proliferación y migración al borde de la lesión21,22, por lo que la reducción del área de la cicatriz glial por histidina posiblemente puede estar relacionada con estos aspectos. Para probar esta hipótesis, se examinó la activación de los astrocitos en el área de penumbra mediante inmunohistoquímica y transferencia Western. Después de la isquemia cerebral, los astrocitos se activaron sorprendentemente con una mayor expresión de GFAP; sin embargo, el tratamiento con His 1000 no tuvo más efecto sobre la activación de los astrocitos en 7 días después de la isquemia, ni tampoco los tratamientos con His 1000–0 y 1000–500 en 14 días después. isquemia (Suplemento Fig. 2; n = 6–7). Posteriormente, se evaluó la proliferación de astrocitos a partir de la cuantificación de células BrdU+/GFAP+ en la zona de penumbra. Aunque el número de células BrdU+ aumentó después del tratamiento con His 1000–500, el número de células BrdU+/GFAP+ permaneció sin cambios (Suplemento Fig. 3; n = 6–7), lo que indica que la histidina no tiene efecto sobre la proliferación de astrocitos. El ensayo de cicatrización de heridas en cultivo de astrocitos nos permite analizar la acción directa de la histamina sobre la activación, proliferación y migración de los astrocitos. La expresión de GFAP y el número de células BrdU+ no cambiaron en el límite de la herida después del tratamiento con histamina (Suplemento Fig. 4). Por lo tanto, es improbable que la regulación de la activación y proliferación de astrocitos contribuya a la reducción del área de cicatriz glial por la histidina.

Para investigar si la acción de la histidina sobre la migración de los astrocitos se atribuye a la reducción del área de la cicatriz glial, se cuantificó la distribución de los astrocitos midiendo el área del infarto rodeada de astrocitos reactivos. A los 7 días después de la isquemia, no hubo diferencia en el tamaño del área de infarto entre los grupos control y His 1000, mientras que a los 14 días después de la isquemia el área de infarto se redujo notablemente en el grupo His 1000-500 en comparación con los controles (33,7 ± 2,1% vs. 49,0 ± 2,3 %, P < 0,001; Fig. 3A, B; n = 6–8), lo que sugiere que la histidina facilita que los astrocitos migren hacia el núcleo del infarto en la última etapa del tratamiento después de la isquemia cerebral. El hecho de que el área del infarto a los 14 días no cambiara en el grupo His 1000–0 en comparación con los controles sugiere que el tratamiento con histidina en la última etapa fue indispensable para la migración de los astrocitos hacia el núcleo del infarto (43,7 ± 2,7 % frente a 49,0 ± 2,3 %). %; Fig. 3A,B; n = 6–8), lo que podría resultar en una formación de cicatriz de barrera cicatricial más delgada más adelante (Fig. 2B,D,F).

La histidina promueve la migración de astrocitos reactivos hacia el núcleo del infarto.

La inmunotinción con GFAP se realizó a los 7 y 14 días después de tMCAO (A) y se cuantificó el área del infarto rodeada de astrocitos reactivos (B). La morfología de los astrocitos del borde de la cicatriz glial indicada por flechas en A se mostró en C1–3, con imágenes ampliadas en C4–6 (GFAP: verde; DAPI: azul). Las flechas en C4–6 indican los astrocitos polarizados. La longitud (D), el ancho (E), la relación entre la longitud y el ancho de las protuberancias (F) y el porcentaje de astrocitos polarizados (G) se cuantificaron en el borde de la cicatriz glial 14 días después de tMCAO. n = 6–8. A: barra = 1 mm; C1–3: barra = 100 μm; C4–6: barra = 50 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, en comparación con el grupo tMCAO, #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, en comparación con el grupo His 1000–0.

La migración celular es un proceso de varios pasos altamente orquestado. Para migrar, una célula primero adquiere una morfología polarizada característica en respuesta a señales extracelulares, caracterizada por una protuberancia alargada19. Analizamos la morfología de los astrocitos en el borde de la cicatriz glial (Fig. 3C–G; n = 6–8) y encontramos que el tratamiento con His 1000–500 pero no con His 1000–0 aumentó significativamente la longitud relativa de (1,36 ± 0,10 vs. 1,00 ± 0,03; P < 0,01), pero redujo el ancho relativo de las protuberancias de astrocitos (0,66 ± 0,05 frente a 1,00 ± 0,05; P < 0,01) y, por lo tanto, elevó la relación entre longitud y anchura (2,22 ± 0,34 frente a 1,00 ± 0,04 ; P < 0,01). Además, el porcentaje de células polarizadas con el criterio de que la longitud de la protuberancia superaba el ancho en al menos cuatro veces, aumentó en el grupo de tratamiento His 1000-500 (40,1 ± 2,7 frente a 21,9 ± 2,4; P <0,001).

Para confirmar el efecto de la histamina en la migración de astrocitos, la distancia de migración se evaluó mediante un ensayo de curación de heridas (Fig. 4A, B; de 3 a 4 experimentos independientes). La histamina impulsó en gran medida la migración de astrocitos en el límite de la herida, y la dosis de 10-7 mol/L mostró el efecto máximo (1,86 ± 0,10 frente a 1,00 ± 0,06; P < 0,001). En el ensayo de migración transwell que es otra prueba común para la respuesta migratoria celular, nuevamente encontramos que había más células migradas después de la administración de histamina (Fig. 4D, F; de 3 a 4 experimentos independientes). La histamina 10-7 mol/L mostró la máxima promoción en la migración de astrocitos (1,67 ± 0,03 vs. 1,00 ± 0,10; P < 0,001), mientras que dicho efecto se redujo con el aumento de la dosis.

La histamina promueve la migración de astrocitos en el ensayo de cicatrización de heridas y el ensayo de migración transwell in vitro.

Las micrografías de contraste de fase muestran la migración de astrocitos bajo el tratamiento de histamina (HA) 10-7 mol/L a las 0 h, 24 h y 48 h después del rasguño (A, las líneas blancas indican los bordes de la herida). La distancia de migración se cuantificó bajo las diferentes concentraciones de histamina a las 24 h después del rascado (B). El efecto de la histamina en la migración de astrocitos también se analizó en el ensayo de migración transwell (F), con imágenes representativas de astrocitos migrados bajo el tratamiento de histamina 10-7 mol/L (D). Las células con lamellipodia en el límite de la herida se contaron a las 2 h o 4 h después del rascado bajo el tratamiento de 10-7 mol/L de histamina (G), con imágenes representativas teñidas con rodamina-faloidina para mostrar F-actina (C, las flechas indican las células con lamelipodia). A las 24 h después del rascado, las células bajo tratamiento con histamina 10−7 mol/L se tiñeron con GFAP en verde y DAPI en azul. Se analizó la morfología de los astrocitos en el límite de la herida, incluida la longitud (H), el ancho (I), la relación entre la longitud y el ancho de las protuberancias (J) y el porcentaje de astrocitos polarizados (K), con las imágenes representativas que se muestran en (MI). El porcentaje de astrocitos que se adhieren a poli-L-lisina y laminina 30 min después de la siembra se cuantificó en L. Los valores son de 3 a 4 experimentos independientes. C: barra = 50 μm; D, E: barra = 100 μm. *P < 0,05, **P < 0,01,***P < 0,001, en comparación con el grupo de control (CON).

En el frente de la célula, el ensamblaje de la actina impulsa la extensión de protuberancias de membrana plana llamadas lamelipodia, lo que contribuye a la polarización celular para la migración23. Como se muestra mediante una tinción de actina filamentosa (actina F), la histamina aumentó el porcentaje de células con lamelipodia en el límite de la herida (Fig. 4C, G). Luego examinamos la morfología de los astrocitos en el límite de la herida mediante inmunotinción con GFAP. Como se muestra en la Fig. 4E, H-K (de 3 a 4 experimentos independientes), similar a la in vivo, la histamina aumentó notablemente la longitud relativa de las protuberancias (1,38 ± 0,02 frente a 1,00 ± 0,02; P <0,001), relación de largo a ancho de las protuberancias (1,85 ± 0,06 frente a 1,00 ± 0,04; P < 0,001), porcentaje de células polarizadas (77,5 ± 3,3 frente a 31,9 ± 2,5; P < 0,001), pero redujo el ancho relativo de las protuberancias (0,75 ± 0,02 vs 1,00 ± 0,04; P < 0,001). Luego de la polarización, las células forman adherencias que conectan la matriz extracelular al citoesqueleto de actina para anclar la protuberancia y traccionar el cuerpo celular, por lo que la alteración de la adherencia también podría influir en la migración24. Sin embargo, nuestro estudio indicó que la capacidad de adhesión de los astrocitos no cambió después del tratamiento con histamina, que se probó en una superficie recubierta de poli-L-lisina o laminina (Fig. 4L). Juntos, estos resultados sugieren que la histamina facilita la migración de los astrocitos hacia el núcleo del infarto, probablemente a través de la promoción de la polarización de los astrocitos.

Tanto los receptores de histamina H1 como los H2 se han encontrado en astrocitos25,26, mientras que sus funciones exactas se desconocen en gran medida. Encontramos que la antamina agonista H2 tenía una acción similar a la histamina en la migración de astrocitos en el ensayo de cicatrización de heridas, mientras que la cimetidina y la famotidina antagonistas H2 anularon el efecto promocional de la histamina en la migración de astrocitos (Fig. 5A; de 3-4 experimentos independientes). Por otro lado, el antagonista H1 pirilamina no puede inhibir la acción de la histamina antes mencionada (Suplemento Fig. 5). La PKA se encuentra en la vía de señal descendente de la activación del receptor H2 de histamina27. Encontramos que el inhibidor de PKA Rp-cAMP también revirtió la migración de astrocitos promovida por histamina (Fig. 5A; de 3 a 4 experimentos independientes), lo que confirmó aún más la participación del receptor H2 en la acción de la histamina en la migración de astrocitos. Además, la administración de cimetidina, famotidina, pirilamina y Rp-cAMP solos no tuvo efecto sobre la migración de astrocitos.

La histidina promueve la migración de astrocitos y brinda neuroprotección a través del receptor H2.

En el ensayo de curación de heridas, se administró cimetidina (Cime) a 10-7 mol/L, famotidina (Famo) a 10-7 mol/L o Rp-cAMP a 10-5 mol/L después del rascado, mientras que 10- Se añadieron 7 mol/L de histamina (HA) o 10-8 mol/L de amtamina (Amth) 30 min más tarde. Sus efectos sobre la migración de astrocitos se muestran en (A). Los tratamientos con cimetidina también se dividieron en dos fases (primera semana y semana posterior), durante las cuales no se administró cimetidina o se administró a dosis de 20 o 100 mg/kg 30 min antes de cada inyección de histidina, incluidos Cime 20–20, Cime Regímenes 100–100, Cime 0–100 y Cime 100–0. La morfología de los astrocitos del borde de la cicatriz glial 14 días después de tMCAO se mostró en B (GFAP: verde; DAPI: azul). Se cuantificaron la longitud (C), la anchura (D), la relación entre la longitud y la anchura de las protuberancias (E) y el porcentaje de astrocitos polarizantes (F). El área de infarto rodeada de astrocitos reactivos se cuantificó en (G). La puntuación del déficit neurológico se evaluó en 1 d, 3 d, 7 dy 14 d después de tMCAO (H), mientras que el área de infarto también se estimó con la tinción de TB (I). A: los valores son de 3 a 4 experimentos independientes; B–I: n = 10–12. Barra = 50 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, en comparación con el grupo de control (A) o el grupo tMCAO (C–I) dentro de cada día de prueba o cada prueba; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, en comparación con la histamina o el grupo His 1000–500 dentro de cada día de prueba o cada prueba.

Para verificar la participación del receptor H2 en las acciones de la histidina in vivo, se inyectó cimetidina antes de cada tratamiento con histidina (Fig. 5B-I). Descubrimos que la polarización de los astrocitos en el borde de la cicatriz glial también se atenuó con la inyección de cimetidina (100 mg/kg) durante 0–14 d o 7–14 d (referido a Cime 100–100 o Cime 0–100 combinaciones, respectivamente) , que se manifestó por la longitud más corta de las protuberancias y el porcentaje reducido de células polarizadas pero con un mayor ancho de la protuberancia, en comparación con el tratamiento con His 1000–500 solo (Fig. 5B–F; n = 10–12). La reducción del área del infarto rodeada por astrocitos reactivos después del tratamiento con His 1000-500 también fue anulada por la inyección de cimetidina (100 mg/kg) durante 0-14 días o 7-14 días después de la isquemia (Fig. 5G; n = 10-12 ). Sin embargo, el tratamiento con cimetidina durante 0–7 días (100 mg/kg, referido al tratamiento combinado Cime 100–0) no tuvo tal efecto, lo que sugiere que el bloqueo del receptor H2, especialmente en la etapa tardía, revirtió la promoción de la migración de astrocitos por la histidina. .

La puntuación del déficit neurológico y el área del infarto también se evaluaron después de la inyección de cimetidina (Fig. 5H, I; n = 10-12). Nuevamente, la inyección de cimetidina (100 mg/kg) durante 0–14 días o 7–14 días, pero no 0–7 días, revirtió la reducción inducida por histidina del puntaje de déficit neurológico evaluado 14 días después de la isquemia cerebral, cuando la migración de astrocitos también ha ocurrido (Fig. 5H; n = 10-12). Paralelamente, la reducción del área de infarto proporcionada por la histidina fue anulada por la cimetidina (100 mg/kg) inyectada durante 0-14 días o 7-14 días (Fig. 5I; n = 10-12). Por otro lado, la pirilamina antagonista del receptor H1 no tiene efecto sobre la acción de la histidina en la polarización de los astrocitos (Suplemento Fig. 5). Estos datos indican que el efecto promotor de la histamina sobre la migración de astrocitos está mediado por el receptor H2, lo que puede contribuir a su efecto neuroprotector.

Numerosos estudios han revelado que las Rho GTPasas, incluidas RhoA, Rac1 y CDC42, son cruciales para las vías de señalización que subyacen al establecimiento de la polarización que precede a la migración celular, entre las cuales se cree que Rac1 es el principal activador en la formación de lamellipodia23. Descubrimos que la histamina aumentó el nivel de Rac1 activo según lo examinado por el ensayo desplegable de GTPasa que prueba Rac1 unido a GTP, mientras que la cimetidina y Rp-cAMP abolieron la regulación positiva de Rac1 por histamina (Fig. 6A; de 3–4 experimentos independientes). Además, el inhibidor de Rac1 NSC23766 revirtió la promoción de la migración de astrocitos inducida por histamina (Fig. 6B; de 3 a 4 experimentos independientes), lo que sugiere que la histamina puede facilitar la migración de astrocitos a través del receptor H2 y la posterior regulación positiva de Rac1 activo.

La inhibición de la pequeña GTPasa Rac1 impide la migración de astrocitos y la recuperación neurológica proporcionada por la histidina.

En el ensayo de curación de heridas, se administró cimetidina (Cime, 10-7 mol/L) o Rp-cAMP (10-5 mol/L), inhibidor de Rac1 NSC 23766 en la concentración indicada después del rascado, mientras que 10-7 mol/L se añadió histamina (HA) 30 min más tarde. La pequeña GTPasa Rac1 unida a GTP se examinó mediante análisis de transferencia Western a las 24 h después del rascado (A). La cuantificación de la distancia de migración a las 24 h después del rasguño se muestra en B. Después de tMCAO, se administraron 50 μg de NSC23766 en el ventrículo cerebral 30 min antes de cada inyección de histidina desde 7 días hasta 14 días después de tMCAO. Sus efectos sobre el área del infarto rodeada de astrocitos reactivos y sobre la morfología de los astrocitos en el borde de la cicatriz glial 14 días después de tMCAO se mostraron en (C, D) con inmunotinción GFAP (GFAP: verde; DAPI: azul). Se cuantificaron la longitud (E), la anchura (F), la relación entre la longitud y la anchura de las protuberancias (G) y el porcentaje de astrocitos polarizados (H). La puntuación de déficit neurológico (I) se evaluó en 1 día, 3 días, 7 días, 14 días y 28 días después de tMCAO, mientras que las habilidades cognitivas se evaluaron mediante la prueba de condicionamiento del miedo contextual y con claves (Día 27, J) y el laberinto acuático de Morris. (Día 22–24, K) con rutas de natación representativas (Día 24, el círculo gris indica la ubicación de la plataforma). El área de cicatriz glial (L) y el área de infarto (M) de la tinción de TB se determinaron 28 días después de tMCAO. A y B: los valores son de 3 a 4 experimentos independientes; C–L: n = 10–12. D: barra = 50 μm; L: barra = 100 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, en comparación con el grupo de control (A,B) o el grupo simulado (J,K) dentro de cada día de prueba o cada prueba; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, en comparación con el grupo de tratamiento con histamina A y B) o el grupo tMCAO (C–M); &P < 0,05, &&P < 0,01, &&&P < 0,001, en comparación con el grupo His 1000–500 dentro de cada día de prueba o cada prueba.

Para verificar aún más la participación de la migración de astrocitos en el efecto protector de la histidina, el inhibidor de Rac1 NSC23766 se administró en el ventrículo cerebral durante 7 a 14 días después de tMCAO, tiempo durante el cual los astrocitos migraron hacia el núcleo del infarto (Fig. 3A,B). El área del infarto rodeada de astrocitos reactivos se agrandó después de la administración de NSC23766 junto con el tratamiento con histidina (Fig. 6C; n = 10-12). La polarización de los astrocitos también fue anulada por NSC23766, como lo demuestran los aumentos en la longitud, la relación entre la longitud y el ancho de las protuberancias y el porcentaje de células polarizantes, pero la disminución en el ancho de la protuberancia (Fig. 6D-H; n = 10–12), lo que sugiere que NSC23766 puede inhibir la migración de astrocitos regulados al alza por histidina. NSC23766 también revirtió la mejora de la función neurológica inducida por histidina después de la isquemia cerebral (Fig. 6I; n = 10–12). En la prueba de condicionamiento del miedo y la prueba del laberinto de agua de Morris, NSC23766 revirtió de manera sólida la mejora de las capacidades cognitivas conferida por la histidina (Fig. 6J, K; n = 10–12). Además, NSC23766 anuló la reducción inducida por histidina del área de la cicatriz glial (Fig. 6L; n = 10-12; 0,58 ± 0,03 frente a 0,39 ± 0,03; P < 0,001) y el área de infarto como lo indica la tinción de TB (Fig. 6M n = 10-12, 38,9 ± 4,2 frente a 27,5 ± 2,4, P < 0,05). Juntos, estos hallazgos sugieren que la migración de los astrocitos es crucial para el efecto neuroprotector de la histidina después de la isquemia cerebral.

Se ha informado que la histamina ofrece neuroprotección en etapas tempranas después de la isquemia cerebral, lo que se atribuye a su acción sobre las neuronas, los astrocitos o las células inflamatorias28. La histidina y su precursor carnosina también tienen neuroprotección directa en estadios muy tempranos tras el inicio de la isquemia cerebral con sus propiedades antioxidantes y antiapoptóticas29,30. Sin embargo, no se ha investigado la acción de la histamina o sus agentes relacionados en la última etapa después de la isquemia cerebral. Aquí, a través de evaluaciones conductuales y patológicas, encontramos que la histidina, que es el precursor de la histamina, proporcionó neuroprotección a largo plazo en una forma dependiente de la dosis y la etapa. Esta protección puede deberse en gran medida a la restricción de la formación de cicatrices gliales mediante la promoción de la migración de astrocitos. Nuestro estudio destaca la regulación de la función de los astrocitos como estrategia terapéutica para las lesiones cerebrales inducidas por isquemia cerebral.

El régimen dependiente de la dosis y la etapa del tratamiento con histidina se propuso en base a los resultados de las pruebas de comportamiento, el examen patológico y el experimento in vitro (Figs. 1, 2 y 4), de la siguiente manera: 1) la histidina a una dosis constante de 1000 mg/kg ha función neurológica mejorada, que sin embargo no es tan notable como el tratamiento con régimen dependiente de la dosis y la etapa; 2) la histidina (1000 mg/kg) solo en la etapa inicial (se refiere al grupo His 1000–0) no tiene efecto protector sobre el déficit neurológico y la memoria del miedo en la etapa tardía; 3) la histidina a una dosis alta de 1000 mg/kg en la etapa temprana y una dosis baja de 200 o 500 mg/kg en la etapa tardía produjo una protección superior con respecto a la función neurológica y el área del infarto, entre los cuales el régimen con dosis de 500 mg/kg al la etapa tardía tiene el efecto protector más prominente, mientras que un régimen con secuencia de dosis inversa con una dosis baja en la etapa temprana pero una dosis alta en la etapa tardía no tiene protección (datos no mostrados); 4) solo el tratamiento con His 1000-500 redujo el área de cicatriz glial; 5) la promoción de la migración de astrocitos in vitro disminuye a medida que aumenta la dosis de histamina, lo que sugiere que una dosis alta de histamina puede no beneficiar la migración de astrocitos que tiene lugar en la última etapa. Por lo tanto, nuestro estudio sugirió que la estrategia de tratamiento dependiente de la dosis y el estadio es eficaz para el tratamiento de la isquemia cerebral.

Los factores subyacentes que contribuyen al efecto protector de este régimen dependiente de la dosis y la etapa pueden ser complicados, probablemente debido a las múltiples acciones involucradas contra la lesión cerebral inducida por isquemia cerebral. La histidina a una dosis de 1000 mg/kg administrada en la etapa temprana después del inicio de la isquemia reduce el volumen del infarto y la muerte neuronal y se sugiere que sus acciones sobre la supervivencia neuronal, la eliminación de glutamato astrocítico y la inhibición de la infiltración de células inflamatorias son los mecanismos subyacentes11,28. Estos eventos agudos o subagudos suelen ocurrir dentro de los días o una semana después de la isquemia, cuando el rescate de astrocitos en esta etapa suele desempeñar un papel beneficioso, mientras que los astrocitos gradualmente forman una barrera firme para impedir la reconstrucción neuronal después de eso. Aunque no se ha investigado un régimen de tratamiento estricto basado en el transcurso del tiempo, bajo el actual régimen combinado de dosis altas y bajas, la histidina redujo notablemente la formación de una barrera cicatricial glial, que puede ser la base de su protección prominente a largo plazo contra la deficiencia conductual y el infarto. Por lo tanto, el sistema histaminérgico probablemente puede ser un objetivo terapéutico prometedor a través de sus acciones de orquestación de los astrocitos después de la isquemia cerebral en una forma dependiente de la dosis y la etapa.

Además, nuestro estudio indicó que la histidina o la histamina no afectaron la proliferación y activación (Suplemento Figs. 2-4), sino solo la migración de astrocitos (Fig. 3), lo que resultó en una barrera de cicatriz glial más delgada (Figs. 2B, D ,F y 6L). Además, encontramos que la promoción de la migración de astrocitos contribuye a la protección, evidente por el hecho de que el bloqueo de la migración de astrocitos por NSC23766 abolió la neuroprotección inducida por histidina (Fig. 6). Otros estudios también sugirieron la contribución de la migración de astrocitos a la neuroprotección. En la lesión de la médula espinal, se observó un efecto beneficioso después de la estimulación de los astrocitos migratorios a través de la inhibición de la glucógeno sintasa quinasa-331. Además, la adrenomedulina proporciona neuroprotección contra la lesión inducida por isquemia cerebral al tiempo que mejora la migración de astrocitos32. Cabe señalar que esta migración a menudo se refiere a un movimiento o desplazamiento de astrocitos hacia el núcleo del infarto, que puede ser diferente de la migración de astrocitos para formar una cicatriz glial, en la que los astrocitos se acumulan en el área de penumbra.

Una preocupación directa sobre los beneficios de la migración de astrocitos puede ser que conduce a una cicatriz glial compactada para formar una barrera más delgada (Figs. 2B, D, F y 6L) y genera un área de penumbra más grande sin cicatriz glial (Figs. 3A, B y 6C ), a fin de favorecer la neurogénesis en el área de penumbra. Esta noción es plausible ya que se encontraron más neuronas recién nacidas en el borde de la cicatriz glial después del tratamiento con histidina, que fue anulado por el inhibidor de Rac1 NSC 23766 junto con el bloqueo de la migración de astrocitos (Suplemento Fig. 6). Además, los astrocitos migrados pueden contraer las células inflamatorias en el núcleo del infarto, lo que se ha confirmado en la lesión de la médula espinal31. Además, vale la pena señalar que el control de la formación de cicatrices gliales mediante la manipulación de la migración de astrocitos puede ser un enfoque superior para producir neuroprotección, ya que otras formas de lograr una menor formación de cicatrices gliales, como la inhibición de la activación y proliferación de astrocitos, pueden afectar la función normal de los astrocitos y hacer que el área de la lesión se extienda en la etapa temprana de la isquemia. De hecho, la ablación de la activación de los astrocitos mediante el uso de GFAP de astrocitos y ratones con doble knockout para vimentina aumentó el volumen del infarto, lo que puede estar relacionado con los cambios en el transporte de glutamato, las uniones comunicantes y la expresión del inhibidor-1 del activador del plasminógeno en los astrocitos33.

La migración de los astrocitos está mediada por los receptores H2, como se indica en nuestra investigación con la aplicación de antagonistas y agonistas del receptor H2 y mediante el bloqueo de su vía de señalización in vitro (Fig. 5). Además, el antagonista H2, pero no el antagonista H1, también inhibió la migración de astrocitos e invirtió la reducción del área de infarto inducida por histidina. Cabe señalar que, durante todo el curso del tratamiento con antagonista H2, solo se observaron efectos similares a los descritos anteriormente en la etapa tardía después de la isquemia cerebral, tiempo durante el cual se desarrolla la migración de astrocitos. Por lo tanto, la activación del receptor H2 en los astrocitos facilita la migración de los astrocitos hacia el área del infarto confiriendo neuroprotección al menos en la etapa tardía después de la isquemia cerebral, mientras que el receptor H1 probablemente no esté involucrado (Suplemento Fig. 5).

Las múltiples acciones de la histamina después de la isquemia cerebral pueden depender en gran medida de la participación de sus múltiples receptores, como los receptores H1 y H2, que afectan a diferentes células a través de diferentes acciones12,28,34,35. Nuestro estudio reveló un efecto novedoso de la histamina sobre la migración de astrocitos a través del receptor H2 para proporcionar neuroprotección a largo plazo. Además, no se puede excluir el efecto directo de la histidina sobre las alteraciones cognitivas después de la isquemia cerebral, ya que se ha descubierto que la histamina mejora el aprendizaje y la memoria36,37,38. La administración de histamina en el hipocampo mejora los déficits de memoria espacial en la tarea del laberinto del brazo radial a través de los receptores H1 y H236. Las inyecciones bilaterales posteriores al entrenamiento de los agonistas del receptor H2 amtamina o RAMH en el hipocampo dorsal facilitan la consolidación de la memoria después del condicionamiento del miedo contextual37. Por lo tanto, la histamina o sus agentes relacionados pueden ser candidatos potenciales para la recuperación funcional durante la lesión por isquemia cerebral a largo plazo.

Las GTPasas Rho desempeñan funciones centrales en la migración celular, entre las que se encuentran la formación de lamelipodia inducida por Rac138. Se observó una alta proporción de astrocitos polarizados y formación de lamelipodios en astrocitos cultivados tratados con histamina o en el borde de la cicatriz glial en tejido de ratas tratadas con histidina. Además, la pequeña GTPasa Rac1 activa unida a GTP fue regulada por histamina, que puede revertirse con cimetidina o Rp-cAMP. NSC 23766, un inhibidor específico de Rac1 anuló la promoción de la migración de astrocitos inducida por histamina. Por tanto, la histamina promueve la migración de los astrocitos hacia la zona del infarto a través del receptor H2 y la posterior activación de Rac1, lo que enriquece nuestro conocimiento sobre el papel de la histamina en la migración de los astrocitos en el SNC.

En conclusión, nuestros datos indican que un tratamiento dependiente de la dosis y la etapa con histidina promueve la migración de astrocitos hacia el área del infarto a través del receptor H2 y la posterior regulación positiva de Rac1 activo, lo que beneficia la recuperación de la función neurológica a largo plazo después de la isquemia cerebral. También sugiere que dirigirse al sistema histaminérgico puede ser una nueva estrategia terapéutica para la lesión inducida por isquemia cerebral a largo plazo por sus acciones sobre los astrocitos.

Las ratas macho Sprague-Dawley (SD) que pesaban 250–280 se usaron para experimentos in vivo y las ratas neonatales SD se usaron para experimentos de cultivo de astrocitos. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las pautas éticas del Comité de Experimentación con Animales de la Universidad de Zhejiang y cumplieron completamente con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Se hicieron esfuerzos para minimizar cualquier dolor o molestia y se utilizó el número mínimo de animales. En todos los experimentos siguientes, los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos de control y de tratamiento.

Las ratas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de hidrato de coral (350 mg/kg). La isquemia cerebral focal transitoria fue inducida por tMCAO, como se describió previamente39. Brevemente, se avanzó 18 mm en la carótida interna con una sutura de monofilamento de nailon 6-0, roma en la punta y recubierta con poli-L-lisina al 1%, para ocluir el origen de la arteria cerebral media (ACM). El flujo sanguíneo cerebral (FSC) en el territorio de la arteria cerebral media se determinó mediante flujometría láser Doppler40 (Periflux System 5010; Perimed, Jarfalla, Suecia). Se fijó una sonda de fibra óptica flexible al cráneo sobre la corteza inervada por la parte proximal de la MCA derecha (2 mm caudal a bregma y 6 mm lateral a la línea media). Se excluyeron del estudio los animales con <80% de reducción en CBF en el núcleo del territorio de la ACM. Después de 90 min de oclusión, se realizó la reperfusión retirando el monofilamento. Se excluyeron las ratas cuyo FSC post-reperfusión no alcanza el 60% del FSC anterior antes de la oclusión. La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C mediante una lámpara de calor (FHC, Bowdoinham) durante la cirugía y durante 2 h después del inicio de la reperfusión.

Hubo 4 experimentos separados. Dentro de cada uno, las ratas se asignaron al azar al grupo de tratamiento de la siguiente manera (Suplemento Fig. 7). Experimento 1, las ratas recibieron 200, 500 o 1000 mg/kg de histidina durante la primera semana. Experimento 2, las ratas recibieron 1000 mg/kg de histidina durante la primera semana, pero 0, 200, 500 o 1000 mg/kg de histidina durante las semanas posteriores, que se denominan His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 o Sus 1000-1000 grupos. Para el tratamiento con histidina, se disolvió histidina (Sigma, EE. UU.) en solución salina normal y se inyectó por vía intraperitoneal a las 0 h, 6 hy cada dos días después de tMCAO. Para los controles, a las ratas se les inyectó el mismo volumen de solución salina. Experimento 3, junto con el tratamiento His 1000-500, los tratamientos con cimetidina también se dividieron en dos fases (primera semana y semana posterior), durante las cuales se administró cimetidina (20 o 100 mg/kg) por vía intraperitoneal 30 min antes de cada inyección de histidina, incluida Regímenes Cime 20–20, Cime 100–100, Cime 0–100 y Cime 100–0. Experimento 4, junto con el tratamiento His 1000-500, el inhibidor de Rac1 NSC 23766 (50 μg) se administró al ventrículo contralateral 30 min antes de cada inyección de histidina durante la segunda semana después de tMCAO. La función neurológica se calificó en 1, 3, 7, 14, 28, 42, 56 días después de tMCAO39 y las habilidades cognitivas en el laberinto acuático de Morris (Día 22-25, Día 50-53) y condicionamiento contextual del miedo (Día 26-27, Día 54–55) se evaluaron antes del sacrificio41,42,43. Las ratas se sacrificaron a los 7, 14, 28 o 56 días después de tMCAO para inmunohistoquímica, Western blot o tinción de TB. Los números de animales de inclusión y exclusión para cada grupo se muestran en la Tabla complementaria 1.

Los cultivos de astrocitos corticales primarios se prepararon a partir de ratas SD postnatales de 1 a 2 días como se describió anteriormente44. Se hicieron raspaduras en la capa celular usando una punta de pipeta estéril de 20 μl. A continuación, las placas se enjuagaron con PBS estéril para eliminar los restos celulares y se reemplazaron con medios de cultivo celular nuevos suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 1%. Se añadió cimetidina, Rp-cAMP o NSC23766 en la concentración indicada al medio de sustitución, mientras que se añadió histamina 30 minutos más tarde. A las 0, 24 y 48 h después del raspado, las células se tiñeron con GFAP o se observaron con un microscopio de contraste de fase (Olympus, Japón). La distancia entre los dos bordes del rasguño se determinó midiendo el área de la herida dividida por la longitud del rasguño usando el software NIH Image J. Para el análisis de GTPasas pequeñas, las muestras de proteína celular se prepararon 2 h después del rascado.

Para la inmunohistoquímica, las ratas se anestesiaron con hidrato de coral (350 mg/kg) y se perfundieron transcardiacamente con solución salina normal helada y paraformaldehído al 4%. Los cerebros se extrajeron y se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4 % a 4 °C durante 24 h y luego en sacarosa al 30 % en PBS durante 3 días. Se cortaron secciones de cerebro congeladas a 10 μm en un criostato (Leica, Alemania). Para la inmunocitoquímica, la monocapa de astrocitos se fijó en paraformaldehído al 4% durante 10 min. A continuación, los astrocitos cultivados o las secciones de cerebro se incubaron con suero de burro normal al 3 % en PBS que contenía Triton X-100 al 0,1 % o al 0,3 % durante 15 min, respectivamente. Luego se aplicó el anticuerpo primario para GFAP (1:400, Boster, China) para una incubación durante la noche a 4 °C. Después de lavados repetidos en PBS, se aplicó IgG anti-conejo conjugada con Alexa 488 (1:400; Invitrogen, EE. UU.) durante 2 h de incubación a temperatura ambiente. Para la tinción con actina F, las células se incubaron en rodamina-faloidina (1:500, Invitrogen, EE. UU.) durante 30 minutos en lugar de la incubación con anticuerpos. Después de lavados repetidos, las secciones o los astrocitos cultivados se montaron en medios de montaje que contenían 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1000; Sigma, EE. UU.). Finalmente, las imágenes se tomaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus BX51; Japón). Para la cuantificación de la cicatriz glial, se realizó tinción histoquímica con diaminobencidina. Las peroxidasas endógenas se extinguieron mediante tratamiento con H2O2 al 3 % en metanol y los portaobjetos se bloquearon con suero de cabra normal al 10 %. Luego, los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo para GFAP (1:200, Boster, China) y se procesaron con el kit Histostain-Plus IHC (MR Biotech, China). Luego, las secciones se montaron después de lavarlas tres veces durante 10 min con PBS. La medición del área de la cicatriz glial, el recuento celular y el análisis morfológico se realizaron mediante Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, EE. UU.) y el software Image J (NIH, Bethesda, MD). La longitud de las protuberancias se determinó como la distancia desde la parte posterior del núcleo hasta la punta de las protuberancias. El ancho se determinó en la parte inferior de las protuberancias. Las células polarizadas se puntuaron cuando la longitud de la protuberancia excedía el ancho de la protuberancia al menos cuatro veces45. Se examinaron en total alrededor de 500 astrocitos del área de la cicatriz glial de 3 cortes para cada animal.

Para cuantificar el área del infarto, se cortaron secciones de cerebro coronal en serie a 30 μm en un criostato (Leica, Alemania) y se recogieron cada 1,5 mm en todo el cerebro. Los cortes se tiñeron con TB al 1% para definir tejido sin infarto. El porcentaje del área de infarto se calculó como 100 veces la relación entre el área de infarto y el área hemisférica contralateral total. El área de infarto rodeada por astrocitos reactivos también se estimó después de la inmunotinción GFAP por los mismos medios.

Los astrocitos cultivados se homogeneizaron en reactivo de extracción de proteínas. El Rac1 unido a GTP activo se aisló con el kit GTPase Pull-Down (Thermo, EE. UU.). A continuación, las muestras de proteínas se separaron en geles de poliacrilamida con SDS al 12,5 % y luego se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con leche descremada al 5 %, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra rac 1 (1:500; Millipore, EE. UU.) y GAPDH (1:3000; KangChen, China) a 4 °C durante la noche. Después de lavados repetidos, las membranas se hicieron reaccionar con la sonda molecular anti-ratón IRDye 800 (1:8000, LI-COR Biosciences, EE. UU.) o la sonda molecular anti-ratón IRDye 700 (1:3000, LI-COR Biosciences, EE. UU.) durante 2 H. Las imágenes se adquirieron con el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Biosciences, EE. UU.) y se analizaron.

El ensayo de migración se realizó con la cámara de invasión BD matrigelTM (24 pocillos) según informes anteriores46. Brevemente, se añadieron suspensiones de astrocitos (2 × 106/ml, 0,2 ml que contenían FBS al 1 %) en los insertos transwell, mientras que la histamina a la concentración indicada se cargó en los pocillos inferiores que contenían FBS al 5 %. Después de 24 h de incubación, el inserto se retiró del transwell y las células que no migraban se eliminaron frotando suavemente el interior del transwell con un hisopo de algodón. A continuación, las células migradas se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con cristal violeta. Para el análisis cuantitativo, se contó el número de células migradas en cada inserto.

Los astrocitos a 3 × 105/ml se subcultivaron en 10−7 mol/L de histamina durante 30 min en placas de cultivo de 96 pocillos, que se recubrieron previamente con poli-L-lisina o laminina38. Después de repetidos lavados con PBS, las células se incubaron con MTT (Sigma, EE. UU., 0,5 mg/mL como concentración final) durante 4 ha 37 °C. Luego, se eliminó la capa sobrenadante y se agregaron 100 μL de sulfóxido de dimetilo a cada pocillo. El metabolismo de MTT se cuantificó espectrofotométricamente a 570 nm mediante un lector de microplacas Biotek (EE. UU.).

Todos los datos fueron recolectados y analizados de manera ciega. Los datos se presentan como media ± SEM. Las puntuaciones de déficit neurológico dentro de cada día de prueba se analizan mediante la prueba H de Kruskal-Wallis no paramétrica. Otros datos de comportamiento dentro de cada día de prueba o de cada prueba y otras comparaciones múltiples en el examen patológico y los experimentos de cultivo celular in vitro se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey, mientras que se aplicó la prueba t de Student de dos colas para otras comparaciones entre dos grupos. Además, se utilizó un modelo lineal general para analizar la diferencia de latencia entre diferentes grupos de tratamiento en la prueba del laberinto acuático de Morris, considerando todos los días de prueba. Para todos los análisis, las pruebas fueron bilaterales y se consideró significativa una P < 0,05. El cálculo del tamaño de la muestra se basa en la fórmula: ; μa = 1,62 (a = 0,05); μβ = 1,28 (β = 0,10); σ = la DE media; δ = la diferencia promedio entre los grupos.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81030061, 81273490, 81273506, 81473186), el Programa Nacional de Investigación Básica de China 973 (2011CB504403), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LY12H31006) y el Programa para el Equipo Líder de Zhejiang de Innovación C&T (2011R50014). Estamos muy agradecidos a Muteflame Inc. (Windsor, Canadá) por la edición de idiomas.

Liao Ru-jia, Jiang Lei y Wang Rong-rong contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Farmacología, Laboratorio Clave de Neurobiología Médica del Ministerio de Salud de China, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310058, China

Ru-jia Liao, Lei Jiang, Rong-rong Wang, Ying Chen, Ya Li, Lu Wang, Yu-dong Zhou, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen y Wei-wei Hu

Departamento de Farmacología, Centro de Innovación Colaborativa para el Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Infecciosas, el Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310003, China

Rong-rong Wang, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen y Wei-wei Hu

Departamento de Farmacología, Hospital Infantil de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310006, China

Hua Wei Zhao

Departamento de Radiología, Segundo Hospital Afiliado, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310009, China

Li Yong Jie

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WWH y ZC propusieron la hipótesis, diseñaron los experimentos y escribieron el manuscrito; RJL, LJ, RRW, HWZ y LYJ realizaron los experimentos; RJL, YC, YL, LW y XNZ analizaron los datos; YDZ editó significativamente el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Liao, Rj., Jiang, L., Wang, Rr. et al. La histidina proporciona neuroprotección a largo plazo después de la isquemia cerebral mediante la promoción de la migración de astrocitos. Informe científico 5, 15356 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15356

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Recibido: 30 de noviembre de 2014

Aceptado: 09 de septiembre de 2015

Publicado: 20 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15356

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